Was ist die Annealing-Temperatur bei PCR?

Die Annealing-Temperatur ist die Temperatur im zweiten Schritt des PCR-Zyklus, bei der sich die Primer an die Ziel-DNA anlagern. Sie liegt typischerweise 5°C unter der Schmelztemperatur (Tm) der Primer.

Wie berechnet man die Schmelztemperatur (Tm) eines Primers?

Wallace-Regel (für kurze Primer bis ~20 bp): Tm = 2×(A+T) + 4×(G+C). Vereinfachte Formel (für längere Primer): Tm = 81,5 + 0,41×(%GC) - 675/N. N = Primerlänge in Basenpaaren.

Warum liegt die Annealing-Temperatur unter der Schmelztemperatur?

Die Annealing-Temperatur wird 3-5°C unter Tm gesetzt, damit sich genug Primer an die DNA anlagern können (Spezifität), aber nicht zu weit darunter (Fehlannealing-Risiko).

Welche Formel ist besser: Wallace oder vereinfachte Formel?

Wallace-Regel für kurze Primer (< 20 bp), z.B. Schulübungen. Vereinfachte Formel (Tm = 81,5 + 0,41×%GC - 675/N) für mittellange Primer (20-30 bp). Nearest-Neighbor (NEB/IDT) für wissenschaftliche Arbeit.

Annealing-Temperatur berechnen

Q: Was ist die Wallace-Regel?

Tm = 2×(A+T) + 4×(G+C). Jedes AT-Basenpaar trägt 2°C, jedes GC-Basenpaar 4°C zur Schmelztemperatur bei. Gültig für kurze Oligonukleotide (< 20 bp) ohne Salzkorrektur.

Tm-Rechner für PCR-Primer · Wallace-Regel · Vereinfachte Formel · Schritt-für-Schritt

Primer-Sequenz eingeben → Tm und Annealing-Temperatur sofort berechnet. Mit Wallace-Regel (Schule/Studium) und vereinfachter Formel — plus Erklärung der PCR-Schritte.

Schritt 1: Berechnungsmethode wählen

Primer-Sequenz eingeben

Wallace + vereinfachte Formel

GC-Gehalt & Länge eingeben

Manuell: %GC + N bekannt

Primer-Sequenz (5'→3')

Sequenz (nur A, T, G, C — keine Leerzeichen):

Nur Standardbasen: A, T, G, C. Groß- oder Kleinschreibung egal.

Beispiel-Primer:

Die drei PCR-Schritte und die Annealing-Temperatur

Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) läuft in drei Temperaturschritten ab, die sich viele Male wiederholen. Die Annealing-Temperatur ist der zweite Schritt — sie bestimmt, ob die Primer spezifisch an die Ziel-DNA binden.

94–98°C

Denaturierung (20–30 s): DNA-Doppelstrang trennt sich in Einzelstränge. Wasserstoffbrückenbindungen werden aufgebrochen.

50–65°C

Annealing (20–40 s): Primer lagern sich an komplementäre Sequenz an. Temperatur = Tm − 3 bis 5°C. Zu niedrig → Fehlannealing. Zu hoch → kein Annealing.

72°C

Elongation (30–60 s/kb): DNA-Polymerase (Taq) synthetisiert den neuen Strang vom 3'-Ende des Primers aus. Optimum der Taq-Polymerase: 72°C.

Die Formeln im Vergleich

Wallace-Regel (kurze Primer, <20bp):
Tm = 2 × (A+T) + 4 × (G+C)

Vereinfachte Formel (mittlere Primer, 20–30bp):
Tm = 81,5 + 0,41 × (%GC) − 675/N

Annealing-Temperatur:
Ta = Tm − 5°C (Faustformel)
Ta = Tm − 3°C (für spezifischere Bedingungen)

Welche Formel wann?
Wallace: Schule, Übungsaufgaben, Primer <20 bp, ohne Salzkorrektur.
Vereinfachte Formel: Primer 20–30 bp, gute Näherung für Routinearbeit.
Nearest-Neighbor (NEB/IDT): Wissenschaftliche Arbeit, >30 bp, salzkorrigiert.

Beispiel-Berechnung: Wallace-Regel

Primer: 5'-TTAAAATGATAACCATCTCGC-3' (21 Basen)

Schritt	Berechnung	Ergebnis
Sequenz analysieren	TTAAAATGATAACCATCTCGC	N = 21
A zählen	T,T,A,A,A,A,T,G,A,T,A,A,C,C,A,T,C,T,C,G,C → A=7	A = 7
T zählen	T = 5	T = 5 → A+T = 12
G zählen	G = 2	G = 2
C zählen	C = 4	C = 4 → G+C = 6
Wallace: Tm	2×12 + 4×6 = 24 + 24	Tm = 48°C
Vereinfachte Formel	81,5 + 0,41×28,6 − 675/21	Tm ≈ 63,1°C
Annealing-Temperatur	Tm − 5°C	Ta ≈ 58°C

FAQ

Was ist die Annealing-Temperatur?

Die Temperatur im zweiten PCR-Schritt, bei der sich Primer an die Ziel-DNA anlagern. Typisch: 50–65°C, etwa 5°C unter der Schmelztemperatur (Tm) der Primer.

Was ist die Wallace-Regel?

Tm = 2×(A+T) + 4×(G+C). Jedes AT-Paar = 2°C, jedes GC-Paar = 4°C. Gilt nur für kurze Primer (<20 bp), ohne Salzkorrektur. Für die Schule ausreichend genau.

Warum tragen GC-Basenpaare mehr zur Tm bei als AT-Paare?

GC-Basenpaare bilden 3 Wasserstoffbrückenbindungen, AT-Paare nur 2. Mehr Brücken = mehr Energie zum Aufschmelzen = höhere Tm.

Was passiert wenn die Annealing-Temperatur zu niedrig ist?

Zu niedrig: Primer binden unspezifisch an Fehlsequenzen → unspezifische Banden im Gel. Zu hoch: Primer binden gar nicht → kein PCR-Produkt.

Was ist der Unterschied zwischen Tm und Annealing-Temperatur?

Tm (Schmelztemperatur) = Temperatur, bei der 50% der DNA einzelsträngig ist. Annealing-Temperatur = PCR-Prozesstemperatur, typisch Tm − 3 bis 5°C.

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Daniel Niedermayer

Geschäftsführer

Zuletzt geprüft am: 21. Januar 2026

Verwendete Quellen

Unsere Methodik

Wallace-Regel: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) (Wallace et al. 1979, gültig für <20 bp). Vereinfachte Formel: Tm = 81,5 + 0,41(%GC) − 675/N (für 20–30 bp, Standardsalzkonzentration). Annealing: Ta = Tm − 5°C (Faustformel nach Rychlik 1990). Für wissenschaftliche Präzision: NEB/IDT Nearest-Neighbor empfohlen.

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Wallace-Regel

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Wallace-Regel: Wallace et al. 1979. Vereinfachte Formel: Rychlik 1990. Näherungsformeln — für wissenschaftliche Arbeit NEB/IDT Nearest-Neighbor verwenden. Ohne Gewähr.